电化学生物膜监测技术：微流控水凝胶编码技术用于单细胞中5-羟******嘧啶可视化研究

大家好，今天跟大家分享的是西安交通大学赵永席教授课题组发表在 JACS 上的文章，题目是“Differentiated Visualization of Single-Cell 5‑Hydroxymethylpyrimidines with Microfluidic Hydrogel Encoding”。

基因组中除了四个经典碱基外，还包含化学修饰的DNA碱基。其中 5-******胞嘧啶及其氧化衍生物 5-羟******胞嘧啶（5hmC）等已为人们熟知，而胸腺嘧啶的修饰及其生物学功能仍有待探究。5-羟******尿嘧啶（5hmU）是胸腺嘧啶的衍生物，由于其在细胞中含量低且与 5hmC 结构相似，5hmU 的特异性识别和标记以及单细胞中5hmU和5hmC的同时分析仍是挑战。

本文报道了一种微流控水凝胶编码技术，可实现单细胞中5hmU和5hmC差异可视化。方法流程如图 1所示。首先通过液滴微流控技术分散细胞，裂解后的单细胞及其基因组DNA包裹于单个琼脂糖微凝胶中。然后对5hmU和 5hmC进行标记，先用硫代磷酸酯特异性标记 5hmU，再用叠氮葡萄糖标记 5hmC。标记后的碱基通过化学交联分别编码到各自的DNA条码引物中。原位扩增反应和荧光探针分子实现单细胞中5hmU和5hmC的可视化。最后利用机器学习算法对微凝胶中的5hmU/5hmC四维特征进行解码，实现非致瘤性、癌性和高侵袭性乳腺细胞株的区分。

图 1

作者首先证明了 5hmU 识别和标记的特异性， 具体如下。首先LC-MS/MS测定T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（T4β-GT） 标记后分解的核苷， 结果如图 2A所示，含有5hmU:A的dsDNA基本没有糖基化5hmU核苷，而5hmU:G 和5hmC:G样品标记后生成大量糖基化核苷，证明T4β-GT能有效地将叠氮葡萄糖基转移到5hmU:G中。接着通过 DNA 解链反应和加入 SH-活性试剂（图 2B），证明5hmU可被 5hmU DNA 激酶（5-HMUDK） 和腺苷-5-O-硫代三磷酸（ATP-γ-S） 特异性识别和标记。

图 2

为了得到分散的单细胞并对 5hmU 进行标记，作者设计了一种两股同流液滴芯片， 通过细胞悬浮流与熔融的琼脂糖流合并，将单个细胞包裹进琼脂糖微凝胶中。实验条件下，97%的positive液滴只含有一个细胞（图 3A）。在琼脂糖冷却和凝胶化后，油相微凝胶被转移到水相。微凝胶与 5-HMUDK 和 ATP-γ-S 孵育，标记 5hmU为 5psmU， 5psmU与 5’端修饰的 DNA 引物反应， 该引物可用于滚环放大（RCA） 反应，产生长的单链 DNA 连环体。该连环体可捕获多个荧光探针分子，用于信号放大（图 3B）。单个细胞中 5hmU位点的数量可通过对微凝胶中的斑点进行计数来粗略评估。

图 3

接下来 T4 β-GT 标记 5hmC引入叠氮基团，叠氮基团与5′ DBCO 修饰的DNA引物交联，然后进行RCA反应。选择三种人乳腺上皮细胞系进行实验， 如图 4 所示， 使用单个微凝胶的荧光强度来大致描述这两种碱基在不同细胞系中的丰度。尽管存在显著的单细胞异质性，MCF-7的平均值均高于MCF-10A和MDA-MB-231。还进行了两个荧光通道的共定位分析，以研究 5hmU 和 5hmC在基因组DNA中的位置关系。在这些细胞系中观察到不同且较高的共定位速率。

图 4

此外作者还尝试通过5hmU和5hmC信号（荧光强度和斑点数）鉴别非肿瘤细胞和肿瘤细胞， 如图 5 所示，常规方法难以区分三种细胞系。后利用深度学习自动编码器、机器学习t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）和主成分分析（PCA）等降维算法，分别对二维空间中的原始数据进行可视化。如图 5 所示， t-SNE 算法性能最优，可区分三种细胞系。

图 5

综上，作者首次使用硫代磷酸酯和DNA条码技术对5hmU位点进行了特异性标记，并结合液滴微流控技术和DNA扩增技术，实现了微凝胶包裹的单细胞中5hmU和5hmC的差异可视化分析。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.9b11393。