高速逆流色谱有什么缺点吗？研究进展和高速逆流色谱介绍
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文丨鲁滨逊的日记
编辑丨鲁滨逊的日记
HSCCC是一种连续的液-液分配色谱技术，通过两个不相容的液相之间进行组分分配 而不需要固体支撑[45]。HSCCC主要是利用单向流体动力平衡的现象[46-47]。向螺旋管中注入
互不相溶且平衡的两相溶液，若预先向螺旋管内注入待分离的样品，流动相和固定相不断 地接触混合，样品根据各自不同的分配系数先后洗脱出来，从而实现样品分离[48]。
随着CCC技术的发展，为了实现复杂样品的分离纯化，提高分离效率，降低成本，开发了多种逆流洗脱的模式。复杂样品里各组分浓度差异大、极性区间分布广等难题，可以应用不同的洗脱模式解决[53]。
CCC洗脱模式的发展，主要包括梯度洗脱、循环洗脱、pH 区带洗脱、双模洗脱、洗脱-推挤逆流色谱等[54]。与传统的逆流色谱方法相比，梯度逆流色谱在实践中，涵盖较大的极性范围，更节省时间、有机溶剂[55]。HSCCC循环洗脱模式通常用于在溶剂系统中分配系数相近的异构体 和对映体。pH区带逆流色谱较多的应用在天然产物如生物碱的分离，制备量大、纯度高[56]。
双向洗脱模式，提高了分离分辨率且扩大了逆流色谱分离组分的极性范围[57-58]。洗脱-推挤
逆流色谱，推挤过程柱中保留的样品会按照分配系数从小到大的顺序从色谱柱推挤出来， 极其适用极性范围大的物质分离纯化[59]。
随着CCC技术的发展，为了实现复杂样品的分离纯化，提高分离效率，降低成本，
开发了多种逆流洗脱的模式。复杂样品里各组分浓度差异大、极性区间分布广等难题，可
以应用不同的洗脱模式解决[53]。CCC洗脱模式的发展，主要包括梯度洗脱、循环洗脱、pH 区带洗脱、双模洗脱、洗脱-推挤逆流色谱等[54]。
与传统的逆流色谱方法相比，梯度逆流色谱在实践中，涵盖较大的极性范围，更节省
时间、有机溶剂[55]。HSCCC循环洗脱模式通常用于在溶剂系统中分配系数相近的异构体 和对映体。pH区带逆流色谱较多的应用在天然产物如生物碱的分离，制备量大、纯度高[56]。
双向洗脱模式，提高了分离分辨率且扩大了逆流色谱分离组分的极性范围[57-58]。洗脱-推挤
逆流色谱，推挤过程柱中保留的样品会按照分配系数从小到大的顺序从色谱柱推挤出来， 极其适用极性范围大的物质分离纯化[59]。
HSCCC技术的特点主要有以下几点[51]：(1)操作简便：传统制备方法如柱层析、制 备型的HPLC等，操作步骤繁多且周期较长。而HSCCC对样品的处理简单，能够和在线 检测仪器联用。(2)回收率高：无固体载体吸附，不会有污染、吸附、样品损失等现象。 (3)制备量较大。(4)溶剂的消耗低。(5)分离能力好、速度快。因而HSCCC作为一种 制备技术，广泛应用在天然产物、染料、药品等多个领域的分离和纯化[52]。HSCCC正成 为从复杂天然样品中分离和纯化“小”分子的一种更高性能、高容量和高通量的方法[60]。
HSCCC在黄酮类、苷类、生物碱类化合物的分离应用中，快速、高效、重现性好。 Feng等[61]用大孔吸附树脂并结合HSCCC梯度洗脱分离出黄芪中四种黄酮类化合物。Zhang 等[62]建立了梯度洗脱结合循环洗脱的HSCCC分离模式，分离穿心莲叶中的萜类、黄酮类 化合物。Chen等[63]采用循环逆流色谱法来制备分离黄酮类化合物。Qi等[64]建立了线性梯 度逆流色谱（Linear gradient counter-current chromatography，LGCCC）的分离人参提取液 中4种皂苷的方法。Wang等[65]采用HSCCC从葡萄籽提取物中制备原花青素B1、B2等。 Duanmu等[66]采用高速逆流色谱pH梯度洗脱模式对生物碱进行半制备分离纯化。
高速逆流色谱还应用在分离其他多种复杂活性物质中，快速、简便、高效、重现性好。
Duan等[67]采用pH区带精制逆流色谱法分离马兜铃酸。Wang等[68]用pH梯度逆流色谱， 从忍冬属植物的花以及芽中分离制备绿原酸。林等[69]利用循环逆流色谱对小球藻中化合物 进行分离。Guo等[70]通过多种分离技术结合循环逆流色谱，分离土茯苓根茎的七种多酚。 Lu等[71]采用配位络合物HSCCC方法从除虫菊提取物中分离除虫菊酯。Zhang等[72]、Rodrigo 等[73]、Wang等[74]采用梯度洗脱，分别对罗布麻叶、茜草、生姜提取物进行分离纯化。童 等[75]将循环洗脱模式应用于HSCCC对映体分离。
HSCCC应用于分离纯化天然产物，进样量较大，分离能力良好以及将样品的不可逆吸附损失消除等特点，效果非常理想，在天然产物研究领域的应用将越来越广泛。
本论文主要利用逆流色谱技术对番荔枝叶、佛手参中化学成分进行分离纯化，并对部 分成分进行药理活性研究，对番荔枝叶和佛手参的高效开发、利用具有重要意义。
在已有研究的基础上，本研究的创新点如下：
（1）建立了两种适合于番荔枝叶提取物的两步逆流色谱洗脱方法，即常规逆流色谱
模式结合闭合循环逆流色谱模式和线性梯度逆流色谱模式结合循环逆流色谱模式两种分
离方法。两种方法都实现了番荔枝叶中5种黄酮类化合物的分离纯化。对番荔枝叶粗提物
及分离纯化制备的单体化合物进行了抗氧化和降血糖活性的研究。
- 建立了一种适合于佛手参提取物的梯度洗脱-清扫-顶出的逆流模式，成功分离纯 化佛手参提取物中的7种化合物。
- 传统逆流色谱技术两相溶剂体系筛选过程复杂，对于分配系数相差较大的化合物很难 一次分离成功，同时对于分配系数接近（分离因子较小）化合物的分离存在着一定的困难， 循环逆流色谱洗脱可以显著改善分配系数相似化合物之间的分离效果，是分离该类型化合 物的新型洗脱模式；梯度逆流色谱可以有效实现分配系数相差较大化合物的分离，然而却 存在随着流动相比例改变，引起固定相大量流失的问题，影响分离效果。因此，探索新型 循环和梯度逆流色谱分离模式，对于简化分离流程、提高天然产物分离效率具有重要意义。
- 番荔枝叶富含黄酮类化合物，具有良好的生物活性。本实验建立了两种适合于番荔枝
- 叶中黄酮类化合物洗脱的逆流色谱方法，成功实现了5种黄酮类化学成分的分离。荔枝叶购自安徽亳州药材市场，经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为番荔枝科植
- 物番荔枝的干燥叶，标本存放于山东省分析测试中心标本室（标本号：2017090602）。
称量2 kg番荔枝叶，粉碎机粉碎后装置于圆底烧瓶中，加入95%乙醇5 L回流提取2 次，每次2 h，抽滤，温度50℃下使用旋转蒸发仪减压浓缩，至无醇味，加入适量水分散， 用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，50℃减压浓缩干燥。正丁醇提取物用 100 mL石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:2:8，v/v）溶解和萃取，下相50℃减压浓缩干燥， 得17.6 g番荔枝叶总黄酮，4℃冰箱保存备用，用于进一步逆流色谱分离。
番荔枝叶各提取物和逆流色谱分离组分HPLC分析条件如下：色谱柱为 SYMMETRY-C18(250 mm×4.6 mm，5.0μm)；流动相为乙腈/0.1%乙酸水溶液(16:84，v/v）， 流速为1.0 mL/min，进样量10 uL，检测器波长254 nm。
.HPLC测定分配系数的方法如下：按不同溶剂体系的比例，配制10 mL溶剂，充分振 荡摇匀，静置待分层。先取2 mL上相、下相溶剂于同一试管中，加入待测粗样约1 mg， 剧烈摇晃1 min，静置。待其上、下相完全分离后，每相各吸取约0.8 mL样品置于液相取 样瓶中，用HPLC测定上相、下相中各目标峰的峰面积，上相中各目标峰的峰面积记为 P1，下相中各目标峰的峰面积记为P2。计算样品在不同溶剂体系中的分配系数KD。
样品的分配系数KD按如下公式计算：KD＝P1/P2(P2/P1)
常规逆流色谱溶剂体系和样品溶液的配置：根据选定的溶剂体系各体积占比准确量取
配制溶剂体系，置于分液漏斗中震荡混匀，静置分层，分取上、下相，超声脱气20 min， 上相作为固定相，下相为流动相。样品溶液的配制为称取适量番荔枝叶总黄酮，溶解于10 mL的等体积上、下相溶液，剧烈震荡，充分溶解。
梯度逆流色谱溶剂系统配制：将800 mL乙酸乙酯和100 mL蒸馏水置于分液漏斗，剧烈震荡后静置分层，分取上、下相，上有机相为流动相A，下层的水相为固定相。将800 mL 正丁醇和100 mL蒸馏水置于分液漏斗，剧烈震荡，静置分层，分取上、下相，上层有机 相为流动相B。样品溶液的配制为称取适量番荔枝叶总黄酮，溶解于10 mL的等体积流动 相A和固定相溶液，剧烈震荡，充分溶解。
