二氧化硅重金属检测现象：利用新型纳米材料在不同环境条件下

近年来,荧光碳量子点(C-dots)或石墨烯量子点(GQDs)作为一种新型的碳纳米材料,由于毒性较低,环境友好,合成成本低和制备方法简单,已经在很多领域得到了广泛应用｡

然而,传统的石墨烯量子点含有高密度的缺陷态,导致它们的荧光量子产率非常低(1-5%)｡近来研究表明,通过掺杂其他元素,如氮,硼,硫,磷和氟,可以减少其缺陷态从而提高GQDs的荧光量子产率｡

GQDs中掺杂不同的杂原子,不仅使其成分,形态和内在结构发生一些变化,同时会使GQDs呈现出一些独特的性质｡如,Lee课题组利用强酸氧化和氮掺杂合成了具有锯齿形边缘的近红外石墨烯量子点｡

Dong等人采用一步水热法合成了氮和硫共掺杂的碳点(N,S-CDs),此碳点具有约73%高荧光量子产｡另一方面,杂原子掺杂,也可能改变GQDs的表面性质,带来新的性质和应用｡

因此,掺杂的GQDs可作为荧光探针超灵敏检测不同的分析物,如Fe3 ,Ag 氯霉素(CAP)和2,4,6-***************(TNP)等｡亚硝酸盐中的亚硝酸根离子(NO2-)是一种重要的无机阴离子,通常作为防腐剂被添加到食品中｡

它能引起急性中毒,进入胃后能与蛋白质中的胺反应生成一种高致癌物(N-亚硝胺),同时,在血液中与血红素生成正铁血红蛋白而使其失去送氧功能,是一种对人体健康有害的物质,人们如果长期食用亚硝酸根超标的食物,会引起疾病,严重的会转变为癌症,因此世界卫生组织把NO2-列为一级致癌物质｡

此外,NO2-也是细胞代谢产物之一,监测活细胞中亚硝酸根的含量,对了解细胞凋亡机制具有重要指导意义｡因此,发展一种快速,低成本和灵敏的方法,检测分析环境和生物系统中亚硝酸根离子是非常重要的｡

传统测定亚硝酸根的方法有很多,如离子选择性电极法,化学发光法和电化学检测法等｡然而,这些方法通常需要复杂的处理过程,而荧光分析法是一种高效检测亚硝酸根的方法｡

到目前为止,只有少数荧光探针被报道用于分析测定亚硝酸根｡因此,发展一种新型荧光纳米探针,建立新的荧光法用于成像检测细胞中亚硝酸根是非常期待的｡

本研究以四羟******氯化磷(THPC)和乙二胺封端的聚乙烯亚胺(PEI-EC)为前驱体,通过水热法,制备了氮､磷共掺杂的石墨烯量子点(N,P-GQDs)｡

前驱体在合成碳点中的作用分别为:THPC作为碳源和磷源;富含NH2的聚合物PEI-EC作为氮源和表面钝化剂｡制备得到的N,P-GQDs尺寸小于20nm,厚度为0.36-0.65nm;光学性质表现为:高荧光量子产率,激发依赖的全发射光谱和稳定的荧光性质;除此之外,研究发现NO2-与N,P-GQDs表面的磷酸根､氨基作用,能猝灭N,P-GQDs的荧光｡

基于此,构建了基于N,P-GQDs的荧光探针用于NO2-的灵敏检测,检测限为2.5nmol/L,并用于细胞成像检测NO2-(图2.1)｡

取1.5mL四羟******氯化磷和500µL乙二胺封端的聚乙烯亚胺加入装有25mL超纯水的聚四氟乙烯内瓶中,然后搅拌均匀转移到50mL水热反应釜中密封好,在电热恒温鼓风烘箱里以10℃/min的升温速度加热至230℃或者250℃,反应8h后取出,冷却至室温,得到深棕色液体,使用饱和氢氧化钠溶液调节至中性｡

然后,用滤膜(孔径为0.22μm)过滤移除大颗粒,使用透析袋(1000Da)进行12h透析,透析后的溶液在4℃避光保存｡

将20µL的N,P-GQDs溶液与60µLTris-HCl缓冲溶液(10mmol/LpH7.0)混合｡随后,加入20µL不同浓度的亚硝酸盐溶液并振荡｡静止20min后使用荧光光谱仪在350nm激发下进行其荧光强度测定｡

取人膀胱癌T24细胞接种于96孔细胞培养板中,当细胞密度生长至105个/mL时,将N,P-GQDs溶液以20-100μg/mL的浓度加至每个孔的培养基中,继续孵育24h｡

然后向每个细胞孔中加入10μL1mg/mLMTT溶液｡在37℃孵育3-4h后,除去培养基,加入100μL二******亚砜(DMSO)｡将得到的混合物在避光下振荡15min;最后,使用酶标仪测定各孔中溶液在450nm处的吸光度值,评估N,P-GQDs的细胞毒性｡

用胰酶消化人膀胱癌T24细胞,将细胞悬浮液接种至共聚焦成像专用的细胞培养皿(35mm)中,置于37°C､5%CO2培养箱中培养,当T24细胞在35mm玻璃培养皿的底部上生长至密度为70%时,加入N,P-GQDs溶液孵育20h｡

孵育结束后,用PBS(pH=7.4)轻轻洗涤细胞3-4次除去未进入细胞的N,P-GQDs｡最后,使用激光共焦显微镜(ZeissLSM710,德国)观察细胞,并拍摄荧光成像照片｡

通过控制电热恒温鼓风烘箱的温度,我们分别在230℃和250℃条件下制备了N,P-GQDs230℃和N,P-GQDs250℃两种石墨烯量子点(图2.2a)｡它们的形态和结构通过TEM,HRTEM和AFM进行了表征｡从N,P-GQDs230℃的TEM图(图2.2b)可以观察到,制备的石墨烯量子点尺寸分布在1.5-7.5nm之间,平均尺寸为4.2nm(如插图所示)｡

图2.2c是N,P-GQDs230℃的HRTEM图像,插图为2D快速傅立叶变换(FFT)图｡从图中可以观察到N,P-GQDs230℃具有六角形石墨烯和锯齿形边缘结构,粒径大小约为7nm｡这个结果与Ritter等报道的尺寸在7-8nm的石墨烯量子点具有锯齿形边缘结构是一致的｡N,P-GQDs230℃的厚度通过AFM进行测定｡

图2.2d显示了其厚度约为0.652nm,而石墨烯单层的理论厚度为0.34nm,因此AFM实验数据表明:单个N,P-GQDs230℃是由1-3层单一石墨片组成,它们石墨烯量子点｡

图2.3为选取一部分N,P-GQDs250℃的HRTEM图像和相对应的2DFFT图｡从图2.3e中,可以观察到部分N,P-GQDs250℃具有较大的尺寸(约20nm)｡

有趣的是,理论的石墨烯的2DFFT图像的六角晶格是正六边形的｡而在我们制备的N,P-GQDs中,2DFFT图像中的六方点阵(图2.2c和图2.3b)是非正六边形的,这表明N,P-GQDs包含一定数量的缺陷晶格｡

此外,对比N,P-GQDs250℃和N,P-GQDs230℃的HRTEM和2DFFT图像,可以发现N,P-GQDs250℃比N,P-GQDs230℃具有更好的结晶度｡

N,P-GQDs的元素组成和含量通过X射线光电子能谱(XPS)进行表征｡XPS图(图2.4)表明N,P-GQDs主要含有P､N､C和O四种元素｡

进一步比较发现N,P-GQDs250℃的碳含量比N,P-GQDs230℃高,而氧,氮和磷含量比N,P-GQDs230℃低｡这个结果表明N,P-GQDs230℃比N,P-GQDs250℃具有更高的N和P掺杂比率,这也说明在250℃条件下,原料更容易碳化,合成的石墨烯量子点具有更好的结晶度｡

此外,为了进一步获得N,P-GQDs的晶面常数数据,实验进行了XRD表征｡图2.5的XRD显示在24.1°和43.1°两处有衍射峰,它们分别归属于石墨结构的(002)和(100)晶面,这证实制备的N,P-GQDs是石墨烯结构｡

拉曼光谱可以分析石墨烯结构中杂乱度(或结晶程度)的情况｡如图2.6所示,两个N,P-GQDs样品都显示出D带(约1350cm-1C-C),G带(约1580cm-1C=C)和2D带(2750cm-1)｡

值得注意的是,在N,P-GQDs230℃样品中,可以观察到在1390cm-1有个分叉的强峰,这可能是N,P-GQDs中C-P和C-N键呈现的峰｡

N,P-GQDs250℃的G带比常规的石墨烯的G带(1580cm-1)红移25cm-1,这可能与石墨烯量子点中掺杂异物(N和P)有关｡

另外,ID/IG值常用来表征石墨基材料的紊乱程度,当ID/IG值越大,表明碳核表面的缺陷数目越多,即通过sp3杂化的碳微晶数目越多;当ID/IG值越小结果则相反｡通过计算,N,P-GQDs230℃的ID/IG=0.92而N,P-GQDs250℃的ID/IG=0.86,这说明N,P-GQDs250℃具有更高程度的结晶度｡

也意味着N,P-GQDs250℃比N,P-GQDs230℃具有更低的N和P掺杂比率｡这个结果与HRTEM图像和XPS分析是一致的,进一步证实N和P被成功地掺杂进入石墨烯量子点中,且不同的合成温度导致不同的N,P掺杂比｡

制备的N,P-GQDs230℃在自然光下颜色为淡黄色并且是透明的(见图2.7a,插图左),意味着该N,P-GQDs230℃具有好的分散性和水溶性｡

图2.7(a)为N,P-GQDs230℃的UV-Vis和荧光光谱,从图中可见,合成的N,P-GQDs230℃在水溶液有两个清晰的吸收峰,它们分别为275nm和350nm｡处于275nm的弱峰,应该是N,P-GQDs230℃的C=C键π-π*跃迁引起的｡

而在350nm处的强峰则是由C=O,C=P和C=N键的n-π*跃迁引起的｡与之对应的,在激发光谱中可以观察到357nm和240nm两处激发峰,它们分别因σ-π和π-π*跃迁引起｡

在365nm紫外灯照射下,N,P-GQDs230℃显示出强烈的蓝色荧光(插图2.7a右)｡通过绝地荧光量子产率的测定和计算,N,P-GQDs230℃的绝对量子产率为9.4%,远高于未掺杂的GQDs｡N,P-GQDs250℃的紫外可见吸收光谱如图2.8(a)所示｡

275nm处的强峰来源于C=C键的π-π*跃迁,与N,P-GQDs230℃的紫外可见吸收光谱相比(图2.7a和图2.8a),N,P-GQDs250℃在355nm处的吸收峰是非常弱的,表明N,P-GQDs250℃具有少的N和P杂原子掺杂,这个结果与前面的结构表征一致｡

此外,合成的N,P-GQDs230℃和N,P-GQDs250℃都有激发依赖的荧光光学行为(图2.7b和2.8b),这一现象可能与石墨烯量子点的表面能带有关｡

图2.7(a)N,P-GQDs230℃的UV-Vis光谱图和荧光光谱,插图:N,P-GQDs230℃溶液在自然光照射下(左)和在紫外光照射下的(右)照片｡(b)不同激发波长下N,P-GQDs250℃的荧光发射光谱图｡

N,P-GQDs溶液的荧光强度在一定程度上受溶液酸碱度的影响｡如图2.9所示,N,P-GQDs荧光强度随溶液pH值的增大而减小,在pH<4.0的情况下,N-CDs的荧光强度相对较高,而当的pH>12.0时,N,P-GQDs荧光强度很低｡

强碱性条件下相对不稳定,这是由于N,P-GQDs表面带有大量氨基,在碱性条件下,N,P-GQDs表面上的氨基容易与OH-发生反应,破坏了石墨烯的表面保护层,使得石墨烯量子点的荧光发生猝灭｡

为了考察N,P-GQDs荧光的光稳定性,实验使用365nm(40W)紫外灯持续照射其水溶液70h,如图2.10所示,该N,P-GQDs的荧光强度只减少了30%左右,这表明N,P-GQDs具有良好的抗光漂白性｡

N,P-GQDs优良的光稳定性质有利于N,P-GQDs在传感､细胞成像､长时间跟踪等生化分析方面的应用｡

各种离子和生物分子对N,P-GQDs230℃的荧光响应,如图2.11所示｡可以发现,浓度为10µmol/L的大部分离子,GSH和H2O2对N,P-GQDs230℃的荧光影响都较小,但NO2-可以明显猝灭N,P-GQDs230℃的荧光｡

这个结果表明N,P-GQDs230℃对NO2-具有很好的荧光响应｡此外,我们还发现NO2-对N,P-GQDs230℃的猝灭效果要强于N,P-GQDs250℃｡

对比N,P-GQDs250℃,N,P-GQDs230℃具有更高的N和P掺杂比率,这意味着含有更多的活性位点的N,P-GQDs230℃可以更好的与NO2-作用,破坏N,P-GQDs230℃的表面层,猝灭其荧光｡

在优化的条件下,实验对一系列不同浓度的NO2-进行了检测｡实验结果见下图2.12所示｡从2.12a图中可以观察到,随着NO2-浓度的增大,470nm处的荧光强度值逐渐降低,当NO2-浓度达到0.8µmol/L时,N,P-GQDs230℃的荧光强度已经降低至初始荧光值的30%｡荧光强度比值I0/I(I0为N,P-GQDs230℃的荧光强度值;I为加入NO2-后体系的荧光强度值)与NO2-的浓度在5-30nmol/L范围内呈现良好的线性关系(图2.12b),其线性方程为:I0/I=0.0423[NO2-] 0.8149(R2=0.9960)｡

检测限(3σ,σ=S0/S,)为2.5nmol/L｡低于其它报道的检测方法｡此外,和传统的检测方法对比,荧光检测方法在操作过程具有简单､易操作等优点｡

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